PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA KUALITATIF DAN KUANTITAIF

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838.

Protein merupakan zat makanan yang sangat penting bagi tubuh , karena zat ini selain berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga  berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan memperthankan jaringan yang telah ada. Protein merupakan rantai panjang yang tersusun dari mata rantai asam-asam amino. Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil [-COOH] dan satu atau lebih gugus amino [-NH₂] yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus karboksil. Asam-asam amino yang berbeda-beda berikatan melalui ikatan peptida, yaitu ikatan diantara gugus karboksil satu asam amino dengan gugus amino dari asam amino disampingnya. 

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu ; Secara kualitatif terdiri atas ; reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV.

Penentuan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan adalah dengan menentukan jumlah N yang dikandung dalam suatu bahan. Metode ini dikembangkan oleh kjeldah. Cara kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas 2 cara, yaitu cara makro dan semimikro. Cara makrokjeldahl digunakan untuk contoh yang berukuran besar yaitu 1-3 g, sedang semimikro kjeldahl dirancang untuk contoh yang berukuran kecil yaitu 300 mg. Dalam penentuan protein seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan. Akan tetapi secara teknis hal ini sulit dilakukan, mengingat kandungan jumlah senyawa lain selain protein dalam bahan biasanya sangat sedikit maka penentuan jumlah total N ini tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Kadar protein yang ditentukan dengan cara ini disebut kadar protein kasar (crude protein).

Cara lain untuk menentukan kadar protein adalah dengan metode Lowry-Follin. Protein dengan asam fosfomolibdat dan fosfotungsat dalam suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Konsentrasi protein diukur berdasarkan Optical Density pada panjang gelombang tertentu (OD terpilih). Untuk mengetahui banayaknya protein dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan konsentrasi dengan OD. Pada metode lowry-Follin ini sering digunakan larutan protein standar yaitu Bovine Serum Albumin (BSA). Albumin merupakan salah satu jenis protein globuler yang larut dalam air dan terkoagulasi oleh panas.

  

PENENTUAN KADAR PROTEIN

            Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, reaksi Sakaguchi dan metode Biuret. Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV.

1.     Analisis Protein Secara Kualitatif

1.      Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

2.      Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.
Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

3.      Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

4.      Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.

5.      Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.

6.      Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

2.     Analisis Protein Secara Kuantitatif

Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.Dan  Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut.

1.      Metode Kjeldahl
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

Penentuan Kadar Protein Cara Makrokjeldahl

a.       Timbang bahan yang sudah dihaluskan sebanyak 0,2-2 gr

b.      Masukkan ke dalam tabung destruksi

c.       Tambahkan 20 ml H₂SO₄ pekat dan kjeldahl tablet sebanyak 1-2 butir

d.      Blanko, 20 ml H₂SO­₄  pekat dan kjeldahl tablet sebanyak 1-2 butir (tanpa sampel)

e.       Simpan tabung destruksi pada rak yang tersedia

f.       Siapkan Digestion Unit Buchi untuk destruksi dengan cara nyalakan digestion unit dan scrubber dengan menekan tombol power.

g.      Putar dial pemanas pada alat dengan skala 10 dan biarkan alat melakukan pemanasan selama ± 5 menit.

h.      Pasang penutup tabung destruksi dan simpan rak tabung pada samping alat.

i.        Pasang saluran penghisap dari scrubber.

j.        Setelah 5 menit masukkan rak tabung pada pemanas

k.      Biarkan dial pemanas pada skala 10 selama 5 menit, setelah itu putar dial pada skala 8-9.

l.        Destruksi sampel selama ± 1 jam atau sampai sampel berwarna hijau jernih

m.    Angkat sampel dan tempatkan rak sampel pada samping alat

n.      Putar dial sampai posisi off

o.      Biarkan scrubber menyala selama 15 menit  sampai asapnya habis

p.      Setelah sampel dingin matikan digestion dan scrubber, dan lepaskan saluran penghisapnya (sampel siap didestilasi)

q.      Siapkan distilation unit buchi dengan cara preheating alat yaitu pasang tabung yang bersisi  ± 100 ml aquades pada sampel holder.

r.        Pasang tabung penampung pada bagian sampel receiver

s.       Putar dial ke posisi on dan tunggu sampai penampung terisi  ± 50 ml.

t.        Kemudian putar dial ke posisi off dan alat siap menganalisis sampel

u.      Tambahkan 50 ml aquades ke dalam sampel yang telah didestruksi

v.      Pasang pada sampel holder

w.    Tambahlan NaOH sampai berubah warna (hitam) dengan volume 500-1000 ml.

x.      Tampung hasil destilasi sebanyak 150 ml ke dalam asam borat (4%) 25 ml.

y.      Hasil destilasi ditambah dengan 3-4 tetes indikator BCG-MR.

z.       Titrasi dengan 0,1 HCl, akhir titrasi ditandai dengan timbulnya warna kuning muda (warna kuning jerami).

Kadar Nitrogen total dihitung dengan rumus:

Nitrogen (%)               =

                  Wet basis (%)              =  % N x faktor konversi (6,25)

                  Dry basis (%)             =

2.      Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

3.      Metode Lowry
Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
Pembuatan reagen Lowry B :Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%.

Penentuan Protein dengan Cara Lowry-Follin

a.   Pembuatan Larutan Standar

a.       Membuat larutan standar BSA 0; 0,06; 0,12; 0,18; 0,24; 0,3 mg/ml.

b.      Masukkan cuplikan larutan BSA sebanyak 1 ml untuk setiap konsentrasi ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 1 ml reagen D, segera gojog dengan vortex dan inkubasikan pada suhu ruang selama 15 menit.

c.       Tambahkan 3 ml reagen E ke dalam tabung cuplikan dan harus segera digojog vorteks secepatnya, kemudian inkubasikan pada suhu ruang selama 45 menit dan segera ukur absorbansinya pada 540 nm. Warna biru yang terbentuk tetap stabil selama 45-80 menit sesudah inkubasi.

d.      Buat kurva standar BSA sehingga diperoleh garis regresi hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi.

b.   Penentuan Protein dengan cara Lowry Follin

a.       Larutkan 0,25 g bahan dalam aquades hingga volume 100 ml, kemudian saring.

b.      Masukkan cuplikan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan 1 ml reagen D, segera gojog dengan vortex dan inkubasikan pada suhu ruang selama 15 menit.

c.       Tambahkan 3 ml reagen E ke dalam tabung cuplikan dan harus segera digojog vorteks secepatnya, kemudian inkubasikan pada suhu ruang selama 45 menit dan segera ukur absorbansinya pada 540 nm. Warna biru yang terbentuk tetap stabil selama 45-80 menit sesudah inkubasi.

d.      Hasil peneraan diplotkan ke persamaan regresi dari larutan standar yang sudah dibuat sehingga diketahui konsntrasi proteinnya.

Keterangan :

Pembuatan reagen yang digunakan dalam Penentuan Protein Lowry Follin :

a.             Reagen A : larutkan 100 g Na₂CO₃ dalam NaOH 0,5 N hingga mencapai volume 1000 ml.

b.            Reagen B : larutkan 1 g CuSO₄.5H₂O dalam aquades hingga mencapai 100 ml.

c.             Reagen C : larutkan 2 g K-tartrat dalam aquades hingga mencapai volume 100 ml (Larutan A, B dan C dapat disimpan).

d.            Reagen D : campur 15 ml reagen A, 0,75 ml reagen B dan 0,75 ml reagen C kemudian digojog hingga homogen.

e.             Penyediaan larutan E yaitu dengan mengencerkan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu 2 N menjadi volume 50 ml lalu digojog baik.

4.      Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)

1.         Pembuatan reagen Biuret :
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades
sampai garis tanda.

2.         Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):
Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li).

3.         Penetapan kadar (Metode Biuret) :
Pembuatan kurva baku :
Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut:
Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada ë 550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800 µL
reagen Biuret dan 200 µL aquades.

4.         Cara mempersiapkan sampel :
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva baku.

5.                  Metode Spektrofotometri UV

            Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.
Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x pengenceran